Poehler dilahirkan di Newton, Massachusetts, kepada guru sekolah Eileen dan William Poehler.[7] Adiknya, Greg, merupakan seorang pelakon dan penerbit.[8] Beliau dibesarkan berdekatan Burlington.[7][9] Beliau dibesarkan dalam kepercayaan Katolik,[10] dan tamat belajar di Sekolah Tinggi Burlington pada 1989.[11]

Semasa belajar di Kolej Boston,[2] Poehler merupakan ahli kumpulan komedi improvisasi My Mother's Fleabag.[7] Beliau tamat belajar di Kolej Boston dengan mendapat ijazah sarjana di dalam media dan komunikasi pada 1993 dan berpindah ke Chicago, di mana beliau mengikuti kumpulan rombongan Second City bersama rakan karib dan pelakon Tina Fey.[9][12] Beliau juga belajar bersama Del Close di ImprovOlympic.[9]